人牙周膜干细胞的分离培养

研究证实牙周膜内存在具有横向分化能力的干细胞（牙周膜干细胞），在体外微环境作用下还可分化为成牙骨质细胞或成骨细胞。因此，牙周膜干细胞（PDLSCs）作为-种新发现的干细胞，在牙周组织工程研究中有较大的应用前景。但是牙周膜组织量小、分离困难，-直成为制约牙周膜干细胞研究的重要原因。已有的克隆筛选法操作程序繁琐，周期较长，因此需要寻找简便、快捷的筛选方法来分离牙周膜干细胞。本研究应用免疫磁珠技术对人牙周膜干细胞进行筛选，并扩增培养，通过对牙周膜干细胞生长曲线、克隆形成率、细胞周期、细胞表面抗原标记物测定及多向分化能力的研究对其生物学特性进行研究，以期建立-种便捷有效的分离方法并明确牙周膜干细胞的生物学特性，为进-步研究牙周损伤的发病机理及临床治疗提供基础。

1材料和方法

1．1实验材料和设备：a-MEM培养基（Gibco，美国），羊抗小鼠磁珠试剂盒（Dynalbiotech，美国），基质蛋白-1单克隆抗体（STRO-1，R&D，美国），ABC型免疫组化检测试剂盒（Dkao，美国）；小鼠抗人波形丝蛋白单抗（Vimentin，Dkao，美国）：CD44-FITC、CDl46-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC，小鼠抗人单克隆抗体（Beckmen Coulter，美国）；CO₂孵箱（Heraeus，德国）；YJ-875型超静工作台（苏州净化设备厂，中国）；流式细胞分析仪（Beckmen Coulter，美国）；倒置相差显微镜及照相系统（Olympus，日本）。

1．2实验方法

1．2．1取材及细胞培养：收集临床拔除的正常人牙周健康、无龋的新鲜第3磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织，移入10cm无菌培养皿内，滴加少许α-MEM培养液保持组织湿润，锐性分离牙周膜组织约1mm³组织块，将分离的组织块以1mm间距平铺于6孔板内，以无菌盖玻片覆盖组织块，加入培养液（含100ml/L胎牛血清，100µmol/L2抗坏血酸，2mmol/L2谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100µg/ml链霉素的α-MEM培养液），置入37℃、50ml/L CO₂的孵箱中培养，待多数组织块周围有细胞游出后去除盖玻片，常规培养，每3天换液1次，细胞生长达80％汇合时传代。

1．2．2磁珠分离筛选牙周膜于细胞：将5µl磁珠剧烈振荡后移入离心管内，加入5ml含1％胎牛血清的PBS冲洗，放置于磁力架上静置2min后去上清，重复一次后重悬，置4℃备用。收集第4代人牙周膜细胞1×10⁸个，以含1％胎牛血清的PBS重悬，加入小鼠抗人STRO-1抗体，4℃孵育60min，每隔10min轻振以防沉淀。以含1％胎牛血清的PBS清洗3次，去除残留抗体后重悬并加入磁珠，4℃孵育30min，每5min轻振-次。离心，去除含空白磁珠的上清液，以含1％胎牛血清的PBS重悬，将离心管置于磁力架上2min，缓慢弃除上清及未与磁珠结合的细胞。以含1％胎牛血清的PBS再次重悬并清洗与磁珠结合的细胞2次，弃上清，加入磁珠分离液，轻晃均匀2min后置于磁力架上2min，取上清液，重复2次以去除残存磁珠，离心，加入5ml含10％胎牛血清的α-MEM培养液，重悬，调整细胞浓度为1×10⁴/ml接种于6孔板内，37℃、50ml/L CO₂的孵箱中培养。

1．3牙周膜干细胞生物学特性的研究

1．3．1细胞生长曲线测定：分别取筛选培养的牙周膜干细胞及牙周膜细胞，以1×10³cells/孔接种于96孔塑料板，每组3孔，隔日换液。每天取-组，MTT法测各孔OD值，连续测10天，以时时间为横轴、细胞数为纵轴绘制牛长曲线。

1．3．2克隆形成率测定：将收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清1 500rpm离心10min，经0．22µm直径的小滤器过滤后，与培养基以1：1比例混合作为适应性培养基。取筛选培养的牙周膜干细胞，调整细胞密度至10～15个/ml，100µl/孔接种于96孔培养板中，培养12h后标记单个细胞孔，并补液至200µl/孔，5天换液，光镜下观察克隆形成情况。

1．3．3流式细胞仪分析

1．3．3．1细胞周期分析：取筛选培养的牙周膜于细胞，胰酶消化，调整细胞密度为1×10⁷/ml，PBS清洗2次，加入0．01m01/LPBS重悬，再加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀，4℃过夜，离心弃乙醇，0.01mol/LPBS清洗2次，加入5ml/L碘化丙锭1ml，4"C30min，过300目的尼龙筛网，流式细胞仪上机，进行细胞周期检测。

1．3．3．2表面抗原测定：取筛选培养的牙周膜干细胞，弃去培养液，PBS清洗两次，以含0．25％胰蛋白酶的PBS液消化5min，制成单细胞悬液，再以含2％牛血清白蛋白和0．1％偶氮钠的磷酸盐缓冲液（流式缓冲液）冲洗细胞，调整细胞密度为3.0×10⁹/L，每个Eppendof管加100µL细胞悬液，室温下分别与CD44-FITC、CDl46-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC，小鼠抗人单克隆抗体5µL避光孵育15min，再以流式缓冲液清洗细胞，1000rpm离心5min，将细胞重悬于含1％多聚甲醛的流式缓冲液0.5ml固定。使用同型对照单克隆抗体确定背景标记。用流式细胞仪分析荧光细胞，专用配套软件计算细胞表面抗原阳性率，单位用％表示。

1．3．3．3免疫细胞化学染色：取筛选培养的PDLSCs制备细胞爬片，免疫细胞化学ABC法进行STRO-1及Vimentin染色，阴性对照以PBS替代-抗，进行细胞来源及表达检测，光镜下观察。

1．3．3．4体外多向诱导分化：①矿化诱导：取筛选培养的牙周膜干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为2×10⁴/ml接种于6孔板中，以含10％胎牛血清的α-MEM培养24h后换矿化诱导液（100µg/ml链霉素、100U/ml青霉素、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50µg/ml维生素C、1×10⁸mol/L地塞米松、10ml/L胎牛血清、α-MEM培养液）培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液，PBS清洗，95％酒精固定10min，PBS清洗2次，加入0．1％茜素红（A1izarin Red-S）室温染色30min，去离子水清洗3次，光镜下观察。②成脂诱导：取筛选培养的牙周膜干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁵ml接种于6孔板中，以含10％胎牛血清的α-MEM培养24h后换成脂诱导液（地塞米松10^-6mol/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0．5mmol/L、胰岛素10mg/L、消炎痛100mmol/L、α-MEM培养液）培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液，PBS清洗，10％中性甲醛固定10min，PBS清洗2次，油红0染色lOmin，去离子水清洗3次，镜下观察。

2结果

2．1形态学观察：所筛选细胞大部分呈类梭形，核为卵圆形、位于胞质中央，似成纤维样细胞。

2．2细胞生长曲线测定：牙周膜细胞及牙周膜干细胞生长曲线均呈倒“S”形，在接种后1天两者细胞量均减少，自第2天起，细胞生长均加速，第8天达到生长高峰，进入“平台期”，此后，细胞生长速度减慢。总体而言，干细胞生长速度明显低于牙周膜细胞。